Deux ans ont passé et Peter Parker doit faire face à de nouveaux challenges alors qu'il se débat encore entre la satisfaction du don qu'il a reçu et les tourments qui en découlent.
Il balance sans cesse entre sa double identité, celle du super-héros et celle de simple étudiant. Tourmenté par ses secrets, Peter se rend compte que sa relation avec les gens qui lui sont chers est fortement menacée.
Ses sentiments pour M.J. (Kirsten Dunst) sont de plus en plus forts alors qu'il réprime l'envie de tout lui révéler: son identité et son amour.
Son amitié avec Harry Osborn (James Franco) est altérée par l'amertume de Harry après la mort de son père. Il mène une véritable vendetta contre Spider-Man. Même la tante de Peter, May (Rosemary Harris), qui a eu des difficultés après la morte de son mari, l'oncle Ben, commence à avoir des doutes sur son neveu.
Tout devient incroyablement compliqué alors que Peter rencontre un nouvel ennemi, Dr. Otto Octavius - Octopus pour les Français - (Alfred Molina).
Peter doit user de tous ses pouvoirs afin d'enrayer les plans diaboliques de ce fou dangereux !!