Orphelin depuis sa tendre enfance, Peter Parker (Tobey Maguire) est élevé par sa Tante May (incarnée par l'actrice Rosemary Harris, nommée aux Academy Award®) et son oncle Ben (Cliff Robertson, nominé aux Academy Award®) dans le quartier Queens de New York. Étudiant ordinaire, Peter apprend les rouages du journalisme en travaillant comme photographe pour le Daily Bugle sous la direction de J. Jonah Jameson (J.K. Simmons). Il y fait la rencontre de la belle Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) dont il tombe amoureux. Son meilleur ami est son colocataire Harry Osborn (James Franco).

Lors d'une sortie scolaire, au cours de laquelle Peter et ses camarades assistent à une démonstration scientifique, Peter est mordu par une araignée génétiquement modifiée. Peu après, il découvre qu'il détient des pouvoirs surnaturels : il est doté d'une force et d'une agilité hors du commun, ainsi que d'une perception extra-sensorielle, proche de celle des araignées. Peter apparaît bientôt à la télévision dans le cadre de sa participation à un match de catch. Grâce à ses nouvelles ressources physiques, il met son adversaire K.O. en un temps record. Toutefois, les organisateurs du combat refusent d'accorder à Peter la prime de 3 000 dollars promise au vainqueur, alléguant qu'il aurait gagné trop facilement. Peu après, Peter a l'occasion d'arrêter un cambrioleur qui s'enfuit du bureau de l'organisateur principal... mais il refuse d'agir, assoiffé de vengeance. Il ne tarde pas à le regretter, puisque c'est ce même truand qui assassinera son oncle Ben.

C'est sous l'apparence de Spider-Man que Peter appréhende finalement le cambrioleur, rongé par le remord de n'avoir pas agi plus tôt en héros. Pendant ces moments de confusion, Peter se souvient des mots de son oncle Ben : "Celui qui détient le pouvoir se doit d'être responsable." Peter adopte cette maxime et décide de mettre ses pouvoirs extraordinaires au service de la lutte contre le crime.

Entre-temps, la vie de Norman Osborn (incarné par Willem Dafoe, nommé aux Acadamy-Award®), le père de son ami Harry, un riche industriel mégalo, connaît quelques bouleversements. Un mélange expérimental qui lui explose au visage accroît considérablement ses facultés intellectuelles et sa force physique mais lui fait perdre la raison. Il se transforme ainsi en Bouffon Vert, l'ennemi juré de Spider-Man, qui tente de réduire à néant les efforts de Peter Parker dans sa lutte contre le crime et son combat pour aider les innocents.